Nizozemští vědci kombinují CRISPR a bioluminiscenci v experimentálním testu proinfekční choroby

Nově vyvinutý noční protein by podle vědců z Nizozemska mohl urychlit a zjednodušit diagnostiku virových onemocnění.
Jejich studie, publikovaná ve středu v ACS Publications, popisuje citlivou, jednokrokovou metodu pro rychlou analýzu virových nukleových kyselin a jejich vzhledu pomocí zářících jasně modrých nebo zelených proteinů.
Identifikace patogenů detekcí jejich otisků nukleových kyselin je klíčovou strategií v klinické diagnostice, biomedicínském výzkumu a monitorování bezpečnosti potravin a životního prostředí.Široce používané testy kvantitativní polymerázové řetězové reakce (PCR) jsou vysoce citlivé, ale vyžadují sofistikovanou přípravu vzorků nebo interpretaci výsledků, což je činí nepraktickými pro některá zdravotnická zařízení nebo prostředí s omezenými zdroji.
Tato skupina z Nizozemska je výsledkem spolupráce mezi vědci z univerzit a nemocnic na vývoji rychlé, přenosné a snadno použitelné diagnostické metody nukleových kyselin, kterou lze použít v různých prostředích.
Byly inspirovány záblesky světlušek, světlušky a drobnými hvězdami vodního fytoplanktonu, to vše poháněno jevem zvaným bioluminiscence.Tento efekt záře ve tmě je způsoben chemickou reakcí zahrnující protein luciferázy.Vědci začlenili luciferázové proteiny do senzorů, které vyzařují světlo, aby usnadnily pozorování, když najdou cíl.I když jsou tyto senzory ideální pro detekci v místě péče, v současné době postrádají vysokou citlivost potřebnou pro klinické diagnostické testy.Zatímco metoda úpravy genu CRISPR může tuto schopnost poskytnout, vyžaduje mnoho kroků a další specializované vybavení k detekci slabého signálu, který může být přítomen ve složitých, hlučných vzorcích.
Vědci našli způsob, jak spojit protein související s CRISPR s bioluminiscenčním signálem, který lze detekovat jednoduchou digitální kamerou.Aby se ujistili, že je k analýze dostatek vzorku RNA nebo DNA, provedli vědci amplifikaci rekombinázovou polymerázou (RPA), jednoduchou techniku, která funguje při konstantní teplotě kolem 100 °F.Vyvinuli novou platformu nazvanou Luminiscent Nucleic Acid Sensor (LUNAS), ve které jsou dva proteiny CRISPR/Cas9 specifické pro různé souvislé části virového genomu, každý s jedinečným fragmentem luciferázy připojeným výše.
Když je přítomen specifický virový genom, který vyšetřovatelé zkoumají, navážou se dva proteiny CRISPR/Cas9 na cílovou sekvenci nukleové kyseliny;dostanou se do těsné blízkosti, což umožní intaktní luciferázový protein tvořit a emitovat modré světlo v přítomnosti chemického substrátu..K zohlednění substrátu spotřebovaného v tomto procesu vědci použili kontrolní reakci, která vyzařovala zelené světlo.Zkumavka, která změní barvu ze zelené na modrou, znamená pozitivní výsledek.
Vědci otestovali svou platformu vyvinutím testu RPA-LUNAS, který detekujeRNA SARS-CoV-2bez zdlouhavé izolace RNA a demonstroval svůj diagnostický výkon na vzorcích nasofaryngeálních výtěrů zCOVID 19pacientů.RPA-LUNAS úspěšně detekoval SARS-CoV-2 během 20 minut ve vzorcích s virovou náloží RNA jen 200 kopií/μl.
Vědci věří, že jejich test může snadno a efektivně detekovat mnoho dalších virů.„RPA-LUNAS je atraktivní pro testování infekčních chorob v místě péče,“ napsali.